Universidade
Federal de Viçosa
Pós-graduação em Genética e Melhoramento
Data: 27/11/2008
OTIMIZAÇÃO
DO PROTOCOLO DE EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA, DINÂMICA DE EXPRESSÃO DO GENE SERK E TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE ESPÉCIES DE Passiflora
Mestranda: Daniela Lopes Paim
Pinto
Orientador: Wagner Campos Otoni
O maracujá,
também conhecido popularmente como flor-da-paixão, teve sua produção alavancada
nas últimas décadas no Brasil, o que coloca o país em destaque no ranking
mundial. De acordo com estimativas da ITI Tropicals
(2008) a produção mundial é de 805.000 toneladas, e o Brasil é apontado como o
primeiro produtor, responsável por mais de 55% desse total.
Mesmo com a grande importância econômica
e o potencial de expansão do cultivo da espécie, a
inexistência de um cultivar que reúne as características de homogeneidade e
produtividade além de tolerante às principais pragas e doenças que afetam a
cultura dificulta a elevação da qualidade e produtividade dos pomares
comerciais, representando fator limitante à expansão da cultura.
O uso da biotecnologia moderna e da engenharia genética, como
ferramentas auxiliares no melhoramento genético clássico, torna-se necessário
para que toda a variabilidade genética disponível para o gênero seja utilizada.
Neste sentido, este trabalho objetivou: i) adequação do protocolo de embriogênese
somática para a espécie comercial Passiflora edulis f. flavicarpa, bem como o estudo da
dinâmica de expressão do gene SERK e a caracterização histológica do mesmo processo; ii) otimização da técnica de
transformação genética em Passiflora
via Agrobacterium
utilizando SAAT (Sonication-Assisted Agrobacterium Transformation).
Sementes de P. cincinnata colhidas no pomar do Setor
de Fruticultura da UFV, e sementes de P. edulis f. flavicarpa ‘FB100’, ‘FB200’ e ‘FB300’, obtidas dos Viveiros
Flora Brasil Ltda, Araguari/MG, foram utilizadas como
fonte de explantes.
O processo de indução de embriogênese somática foi seguido conforme descrito por
Silva (2007) para P. cincinnata
e com algumas modificações para P. edulis f. flavicarpa.
Para a caracterização da expressão do
gene SERK a metodologia de
hibridização in situ
em cortes histológicos foi conduzida de acordo com Dornelas et
al. (1999).
Para a transformação genética utilizou-se a linhagem Agrobacterium tumefaciens
GV3101 contendo a construção gênica com dois genes repórteres (GUS e GFP)
clonada no vetor binário pCAMBIA
1304. Os explantes transformados foram submetidos ao
teste histoquímico de GUS e, posteriormente, quantificou-se
as áreas do explante que expressaram o gene,
utilizando o QUANT Image Processing
Software.
Para P. edulis f. flavicarpa
houve a formação de calos embriogênicos em todas as combinações da auxina e
citocinina utilizadas, havendo interação significativa
entre tratamentos e genótipos de acordo com a análise de variância. O
tratamento mais eficiente para indução de calos embriogênicos foi T7 para ‘FB100’,
T11 para ‘FB200’ e T7 para ‘FB300’, sendo que ‘FB100’ foi o genótipo com maior
média de formação de calos embriogênicos. A combinação da mesma
auxina e citocinina, em concentrações diferentes das
utilizadas neste trabalho, também foi eficiente na formação de embriões
somáticos para P. cincinnata (Silva, 2007). A
formação de calos embriogênicos para a espécie P. edulis
f. flavicarpa ainda não havia sido
relatada.
Na fase de diferenciação dos pró-embriões a adição de IAASP (ácido
indolil-3-acetil aspártico) no meio de cultura apresentou resultados positivos, havendo em média 20%
de explantes com embriões diferenciados. Motoike et
al. (2007), também encontraram efeito positivo na adição de IAASP no meio de
diferenciação de embriões somáticos de Myrciaria aureana.
A técnica de hibridização in situ
mostrou que a expressão do gene peSERK
inicia-se após 10 dias de cultivo dos explantes no
meio de indução de embriogênese somática, juntamente
com o início da diferenciação dos tecidos. Após 30 dias de cultivo, é possível
observar a formação de embriões globulares e neles não há expressão de peSERK, mas ainda há
expressão do gene nos tecidos adjacentes, confirmando a hipótese que este gene
marca células competentes para a
formação de embriões. Somleva et al. (2000) relataram que o
aparecimento das primeiras células expressando SERK em culturas embriogênicas de Dactylis glomerata ocorreu
5 dias após o início das culturas e que o gene ainda é expresso até o embrião
pró-globular, não sendo mais observado após este estágio.
De acordo com os dados obtidos pela
transformação transiente dos embriões zigóticos
observou-se que a técnica de SAAT foi eficiente para aumentar a eficiência de
transformação sem causar lesões drásticas nos explantes.
Considerando-se os aspectos de integridade estrutural, a resposta morfogênica in vitro, e a
percentagem de expressão do gene repórter, o tempo de 3 segundos de sonicação foi indicado como sendo o melhor tratamento. Na
otimização da expressão transiente de cotilédones imaturos de soja, a maior
expressão de GUS foi obtida quando os
explantes foram sonicados
por 2 segundos (Santarém et
al., 1998).
Para que o processo de embriogênese somática para P. edulis possa ser aplicado em conjunto
com outras técnicas biotecnológicas, bem como para a propagação clonal em
grande escala, novos estudos devem ser conduzidos visando otimizar
a eficiência de diferenciação histológica dos embriões globulares e a sua
germinação.
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
FALEIRO,
F.G.; JUNQUEIRA, N.T.V.; BRAGA, M.F. (Eds.) Maracujá: germoplasma
e melhoramento genético. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2005.
dornelas, m.c.,
WITTICH, P.; VON
DOLEZEL, J. Flow cytometric
analysis of nuclear DNA content in higher plants. Phytochemical Analysis, v. 2,
p.143–154, 1991.
SILVA,
M.L. Embriogênese somática, produção de
sementes sintéticas e transformação genética de maracujá (Passiflora
cincinnata Masters)
mediada pela técnica de SAAT. 2007. 117 p. Tese (Doutorado em Genética e
Melhoramento) – Universidade Federal de Viçosa, Viçosa.
SOMLEVA, M.N.;
SCHIMIDT, E.D.L.; DE VRIES, S.C. Embryogenic cells in
Dactylis glomerata L.
(Poaceae) explants identified by cell tracking and by SERK expression. Plant Cell Reports, v. 19,
p. 718-726, 2000.
SANTARÉM, E. R.;
TRICK, H.N.; ESSIG, J. S.; FINER, J.J. Sonication-assisted
Agrobacterium-mediated
transformation of soybean immature cotyledons: optimization of transient
expression. Plant Cell Reports,
v.17, p.752-759, 1998.
Daniela Lopes Paim
Pinto Wagner