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 Universidade Federal de Viçosa
Programa de Pós Graduação em Genética
e Melhoramento
SEMINÁRIO DE TESE
Desenvolvimento,
caracterização e utilização de marcadores microssatélites
em Coffea arabica
Estudante: Robson Fernando Missio
Orientador: Dr. Ney Sussumu
Sakiyama
Conselheiros: Dra. Eveline Teixeira Caixeta
Dra. Eunize Maciel Zambolim
Dr. Luiz Antonio
dos Santos Dias
Data: 10/04/2008
RESUMO – Microssatélites ou SSR (Simple Sequence Repeats) correspondem a seqüências de DNA em que um
pequeno número de pares de bases (1-6) de DNA são repetidas
em tandem.
As seqüências ou regiões de DNA que flanqueiam os microssatélites geralmente são conservadas entre os
indivíduos de uma mesma espécie, o que permite desenhar e selecionar primers
específicos que amplificam, por meio de uma reação de PCR, fragmentos
contendo o DNA repetitivo em todos os genótipos. Entre as diferentes classes
de marcadores moleculares, os microssatélites são
os preferidos para aplicações e estudos genéticos no melhoramento de plantas,
principalmente pela sua reprodutibilidade, natureza multialélica,
herança co-dominante, relativa abundância e boa cobertura do genoma. Para
espécies de plantas de importância econômica, principalmente aquelas que já
possuem parte do seu genoma seqüenciado, existe um elevado número de primers SSR
disponíveis para estudos genéticos. Entretanto, para a grande maioria de
plantas, ainda não há um número de primers SSR suficientes para utilização eficiente em
programas de melhoramento genético. Para café, poucos primers SSR foram desenvolvidos
(Moncada & McCouch 2004; Bhat et al. 2005; Poncet et al. 2006; Leroy et al. 2005; Aggarwal et al. 2007), quando comparado com culturas como milho (Peleman et al. 2000), soja (Song et al., 2004),
trigo (Gao et al.
2004), cevada (Marcel et
al. 2006) e cana-de-açúcar (Garcia et al. 2006). Portanto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver, caracterizar e utilizar os marcadores SSR
para estudos de diversidade genética em Coffea arabica. Duas bibliotecas genômicas enriquecidas para as repetições GT15
e AGG10 foram construídas para o desenvolvimento de marcadores
SSR. O DNA genômico da cultivar
Bourbon Amarelo (UFV 570), foi utilizado para construção das bibliotecas. Os
programas SSRIT (http://www.gramene.org/)
e Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/)
foram utilizados para, respectivamente, localizar os SSRs e desenhar os primers. Um total de 835 clones
positivos foi seqüenciado, dos quais 756 apresentaram seqüências de boa
qualidade e foram utilizados para a localização de SSR e desenho de primers. Um
total de 287 repetições SSR foi encontrado, sendo 170 (59,2%) repetições
simples e 117 (40,8%) repetições compostas. A grande maioria dos SSR
encontrados foi de dinucleotídeos (51%) e trinucleotídeos (33%). A classe AG/CT foi a mais
freqüente (64,4%) entre os dinucleotídeos. Entre os
trinucleotídeos, a classe AAG/CTT foi a mais comum
(29,5%). Aproximadamente 15% dos clones foram redundantes, ou seja, apresentaram
a mesma seqüência. Em média foi encontrado um SSR a cada 1,5kb, sendo necessários seqüenciar
aproximadamente 9 clones para desenhar um par de primer SSR. Neste
trabalho, 96 novos primers
SSR foram desenhados e sintetizados para C.
arabica. Trinta e três primers foram escolhidos
aleatoriamente para a validação em 24 acessos do gênero Coffea, sendo que 20 (61%)
apresentaram polimorfismo, quatro (12%) foram monomórficos, quatro (12%) não
apresentaram produtos de amplificação bem definidos e cinco (15%) não
apresentaram nenhum produto de amplificação. Para o estudo da diversidade
genética, foram utilizados 18 primers, os quais produziram um total de 94 alelos, com
uma média de 5,2 alelos por loco. Os valores de PIC, considerando 24 acessos
do gênero Coffea,
variaram de 18% a 87%, com uma média de 50% entre todos os locos. Os maiores
valores de PIC foram encontrados para os acessos de C. canephora (47%), seguidos por
Híbridos de Timor (31%) e variedades resistentes à
ferrugem (29%). Os 18 primers SSRCa foram eficientes em
agrupar os genótipos de acordo com os grupos taxonômicos. Os primers SSRCa 018 e SSRCa
091 permitiram distinguir todos os acessos dentro de C. canephora (T 3751; T 3580; Guarini UFV 514 e Apoatã IAC
2258, do grupo Robusta; e UFV 513, do grupo Conillon),
indicando que estes primers
podem ser de grande utilidade para estudos de fingerprint genético e
certificação de variedades comerciais derivadas de C. canephora. Os marcadores SSRCa desenvolvidos neste
trabalho apresentaram elevado grau de polimorfismo, o que os tornam
eficientes para o estudo da diversidade genética, orientações de cruzamentos,
introgressão genética e mapeamento genético.
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Prof. Dr. Ney Sussumu
Sakiyama Robson Fernando Missio
(Orientador) (Estudante)
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