Universidade Federal de Viçosa

Programa de Pós Graduação em Genética e Melhoramento

Seminário de Tese

Construção de cassete para co-supressão do gene da lisofosfatidilcolina aciltransferase e transformação genética de nós-cotiledonares de soja (Glycine max L.)

Prelecionista: Polyana Kelly Martins

Orientador: Maurílio Alves Moreira

Co-orientadores: Everaldo Gonçalves de Barros, Wagner Campos Otonni

A introdução de características agronomicamente importantes em soja pode ser realizada por transformação genética de plantas como um método alternativo ao melhoramento tradicional. Alterações nas proporções relativas dos ácidos graxos na fração óleo podem ser alcançadas por meio do silenciamento gênico de enzimas do tipo aciltransferases, fosfotransferases e dessaturases, envolvidas na biossíntese de ácidos graxos.

Os objetivos deste trabalho foram: isolar um fragmento do gene da lisofosfatidilcolina aciltransferase (LPCAT) de soja, construir cassete de expressão sob o controle de um promotor semente-específico para a co-supressão deste gene e transformação de nós-cotiledonares de soja. A análise por RT-PCR mostrou que o gene LPCAT é expresso em todos os estádios de desenvolvimento da semente.

Um fragmento de cDNA de cerca de 378 pb foi clonado no vetor binário pCAMBIA 1304, cujo T-DNA apresenta um gene para resistência a antibiótico. A clonagem foi confirmada por meio de PCR, restrição enzimática e seqüenciamento. A construção clonada no vetor pCAMBIA 1304 foi utilizada para a transformação de soja via Agrobacterium tumefaciens. Sementes maduras de soja foram desinfestadas e colocadas para germinar em meio B5 (Gamborg) durante, aproximadamente, 5 dias. A partir de uma semente, dois explantes foram obtidos pela remoção da raiz, da maior parte do hipocótilo e finalmente pelo corte vertical feito para separar os dois nós-cotiledonares. Estes explantes foram transformados com suspensão bacteriana mediante sonicação e adição de acetoseringona Após 3 dias de co-cultivo, os nós-cotiledonares foram transferidos para meio de indução (SIM) sem agente seletivo durante 14 dias. Em seguida, foi adicionado ao meio SIM 5mg/L de Hygromicina B para seleção dos transformantes. Os explantes que sobreviveram a essa seleção foram transferidos para o meio de elongação (SEM), ainda com higromicina, e depois para o meio de enraizamento (RM) sem o agente seletivo.

Após dois meses de inoculação com A. tumefaciens, múltiplos clones genéticos foram produzidos nas regiões nodais resistentes a higromicina que estavam em contato direto com o meio.

Análises a partir do DNA de folhas de plantas em fase de aclimatação permitiram a detecção de vários eventos de transformação. Dezesseis eventos foram confirmados por reações de PCR com primers específicos para seqüências presentes apenas em plantas transformadas. O próximo passo será a quantificação do número de cópias inseridas no genoma das plantas transformadas, via PCR em tempo real.

Bibliografia Consultada

ARAGÃO, F. J. L. 2002. Development of transformation methods toward producing transgenic plants with abiotic stress tolerance. JIRCAS Working Reports, p. 35-42

Passos-Lima, A. B. 2005. Construção de cassete para a co-supressão do gene da oleoil dessaturase e transformação genética de embriões somáticos de soja. Tese Doutorado. 117 p. Universidade Federal de Viçosa. Viçosa, MG.

YADAV, N. S. Genetic modification of soybean oil quality. 1996. In: VERMA, D. P. S., SHOEMAKER, R. C. (Eds) Soybean genetics, molecular biology and biotechnology. USA: CAB INTERNATIONAL, p. 127-188