Universidade Federal de Viçosa

Programa de Pós Graduação em Genética e Melhoramento

Seminário de Tese

 

Prelecionista: Janaína de Oliveira Melo (mestranda)

Comissão orientadora: Prof. Sérgio H. Brommonschenkel (orientador)

                                        Profa. Marisa V. Queiroz

                                        Prof. Eduardo S. G. Mizubuti

 

Clonagem Posicional da Região Genômica de Eucalyptus grandis que Contém o Gene de Resistência Ppr-1

 

         Espécies do gênero Eucalyptus são bastante utilizadas no setor industrial, especialmente na produção de papel e celulose. Em 2006, as exportações do setor de papel e celulose foram de US$ 4,0 bilhões e o saldo comercial foi de US$ 2,9 bilhões (Bracelpa, relatório florestal 2007). Uma séria ameaça para as plantações de Eucalyptus é a ocorrência da ferrugem causada pelo fungo Puccinia psidii Winter (Coutinho et al., 1998; Tommerup et al., 2003; Telechea et al., 2003). O patógeno infecta plantas jovens reduz o crescimento e provoca a morte das mudas para plantio (Carvalho et al., 1998). A alternativa mais viável para o controle do patógeno é a identificação e o plantio de genótipos resistentes à P. psidii.

         Junghans et al. (2003) identificaram marcadores moleculares ligados ao gene de resistência à ferrugem (Ppr1 - Puccinia psidii resistance gene 1) em Eucalyptus grandis. Esses autores estimaram que o marcador RAPD (AT9/917) fortemente ligado a este gene localiza-se a, no máximo, 0,462 cM de Ppr-1 (α=0,01). Considerando-se que em E. grandis a distância genética de 1cM corresponde a uma distância física de 395 kb (Grattapaglia & Bradshaw, 1994), estes resultados sugerem que a distância física máxima estimada entre Ppr-1 e AT9/917  é de ~200kb, tornando exeqüível a clonagem posicional desse gene utilizando bibliotecas BAC. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivos principais isolar e caracterizar estruturalmente clones BAC derivados dessa região genômica, visando a clonagem e caracterização molecular do gene Ppr-1.

         Utilizando marcadores moleculares ligados a Ppr-1 foram identificados três clones BACs com tamanho estimado de 140 kb (BAC-D11), 150 kb (BAC-C04) e 100 kb (BAC-H10). Esses clones foram fragmentados por nebulização e os insertos com média de 2kb foram subclonados em plasmídeos para construção das bibliotecas shotgun. Os plasmídeos recombinantes foram seqüenciados em ambas as extremidades e as seqüências obtidas foram depositadas em banco de dados do Laboratório de Genômica-BIOAGRO e analisadas utilizando o pacote de softwares Phred/Phrap/Consed (Gordon et al., 1998; Ewing et al., 1998; Ewing & Green, 1998). O processo de anotação dos contíguos das seqüências foi realizado utilizando as ferramentas disponíveis no site do “National Center for Biotechnlogy Information” (NCBI, Bethesda, MD, EUA; www.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST), SMS (Sequence Manipulation Suite, http://bioinformatics.org/sms2/) e GenScan (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html).

         Foram obtidas 4663, 3612 e 5624 seqüências referentes às bibliotecas dos clones BAC-H10, BAC-C04 e BAC-D11, respectivamente. A cobertura seqüenciada permitiu a formação de um contíguo para os BAC-D11 e BAC-C04 e dois contíguos para o BAC-H10. A busca por similaridade realizada no site NCBI, utilizando o BLASTX, mostrou a existência de 2 análogos de genes de resistência nos BAC-D11 e BAC-H10 e um análogo no BAC-C04. Além disso, pode-se verificar a presença de elementos retrotransponíveis entre os genes R. Estão sendo feitas análises para determinar as ORFs e regiões de junção entre exons e introns de cada análogo de gene R identificado e estudos para confirmar a localização genômica dos BACs identificados.

 

Referências

 

CARVALHO, A.O., ALFENAS, A.C., MAFFIA, L.A. & CARMO, M.G.F. (1998). Resistência de espécies, progênies e procedências de Eucalyptus à ferrugem, causada por Puccinia psidii winter. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 33: 139-147.

 

COUTINHO, T.A., WINGFIELD, M.J., ALFENAS, A.C. & CROUS, P.W. (1998). Eucalyptus rust: A disease with the potential for serious international implications. Plant Disease, 82: 819-825.

 

EWING, B. & GREEN, P. (1998). Base-calling of automated sequencer traces using Phred II. Error probabilities. Genome Research, 8: 186-194.

 

EWING, B., HILLIER, L., WENDL, M.C. & GREEN, P. (1998). Base-calling of automated sequencer traces using Phred I. Accuracy assessment. Genome Research, 8: 175-185.

 

GORDON, D., ABAJIAN, C. & GREEN, P. (1998). Consed: A graphical tool for sequence finishing. Genome Research, 8: 195-202.

GRATTAPAGLIA, D. & BRADSHAW, H.D. (1994). Nuclear DNA content of commercially important Eucalyptus  species and hybrids. Canadian Journal of Forest Research, 24 (5): 1074-1078.

 

JUNGHANS, D.T., ALFENAS, A.C., BROMMONSCHENKEL, S.H., ODA, S., MELLO, E.J. & GRATTAPAGLIA, D. (2003). Resistance to rust (Puccinia psidii Winter) in Eucalyptus: mode of inherence and mapping of a major gene with RAPD markers. Theoretical and Applied Genetic, 108: 175-180.

 

TELECHEA, N., ROLFO, M., COUTINHO, T.A. & WINGFIELD, M.J. (2003). Puccinia psidii on Eucalyptus globulus in Uruguay. Plant Pathology, 52: 247 (New Disease Report).

 

TOMMERUP, I.C., ALFENAS, A.C. & OLD, K.M. (2003). Guava rust in Brasil – A threat to Eucalyptus and other Myrtaceae. New Zealand Journal of Forestry Science, 33(3): 420-428.

 

                     

          Janaína de Oliveira Melo                                Prof. Sérgio H. Brommonschenkel

                       (mestranda)                                                     (orientador)