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Programa de Pós Graduação em Genética
e Melhoramento Seminário de Tese Prelecionista: Cristiana Libardi Miranda Orientadora: Simone E. Facione
Guimarães - DZO Conselheiros: Paulo Sávio Lopes – DZO Marta M. Fonseca Guimarães -
EMBRAPA EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE GENES A
suinocultura vem crescendo significativamente em volume de produção e obtendo
altos índices produtivos devido aos progressos genéticos alcançados,
apresentando-se como um importante setor entre as atividade
pecuárias no Brasil. Em consonância a um mercado em expansão esta atividade
vem se tornando cada vez mais eficientes e várias metodologias vêm sendo
empregadas com o objetivo de aumentar a produtividade. Dentre as
características produtivas, o número de leitões é fundamental para o sucesso
na produção de suínos e a taxa de ovulação é um dos principais fatores que
determinam o tamanho da leitegada. O estudo da expressão gênica nos folículos
ovarianos, mais precisamente nas células que o recobrem, a camada da granulosa,
pode causar grande avanço no entendimento desta característica. Dessa forma,
o objetivo neste trabalho foi caracterizar a expressão dos genes STAR, PGF2α,
P4R, FSHR, GATA e CYP19 em células da granulosa durante a fase folicular do
ciclo estral de fêmeas suínas de alta e de baixa prolificidade por meio da metodologia de PCR quantitativo
A média do número de leitões por leitegada foi 13,23 e 10, 42, respectivamente, para fêmeas de alta e de baixa prolificidade. O RNA total do líquido folicular foi extraído, imediatamente após a contagem do número de células presentes em cada amostra, utilizando-se o kit RNeasy Mini Kit (Qiagen) de acordo com o fabricante. Após a extração, fez-se dois pools com o RNA total do grupo de fêmeas com alta e com baixa prolificidade. O RNA total de cada um dos pools foi usado na confecção da primeira fita de cDNA utilizando o kit SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen). Foram testadas concentração de primer e cDNA para os genes alvo e para a referência endógena. As reações de qPCR foram realizadas utilizando-se o kit SYBR Green® PCR Master Mix (BioRad), de acordo com as recomendações do fabricante, e como controle endógeno foi utilizado o gene b-Actina. Os primers foram gerados a partir de seqüências obtidas nos bancos de ESTs de suínos. Os genes STAR (Proteína Esteroidogênica Regulatória Aguda), GATA (Proteína de Ligação GATA-4), PGF F2α (Prostaglandina F2α), P4R (Receptor de Progesterona 4), FSHR (Receptor do Hormônio Folículo Estimulante) e CYP19 (Citocromo Aromatase P450) foram escolhidos a partir de dados obtidos nos bancos de ESTs de suínos e as diferenças da expressão de cada gene, representadas pelo valor relativo de 2-∆Ct, está apresentada em medidas relativas, número de vezes que cada gene expressa em cada pool. Dentre eles, a maior diferença de expressão foi observada para o gene P4R, que expressou 7,73 vezes a mais nos animais de baixa prolificidade. O progesterona é responsável pelo estabelecimento e manutenção da prenhez em mamíferos e seus efeitos são mediados pelo seu receptor (P4R) (Ying et al, 2000). Peralta et al (2005), afirmam que os maiores moduladores fisiológicos do PR são os hormônios ovarianos β-estradiol e a progesterona. A expressão do P4R é regulada positivamente pelo estrogênio (up-regulation) e negativamente pela progesterona (down-regulation) na maioria dos tecidos (Bouchard, 1999). O gene PGF2α apresentou expressão diferencial de 2,84 vezes a mais nas fêmeas hipoprolificas. O PGF2α é o principal hormônio responsável pela regressão do corpo lúteo e conseqüente entrada na fase folicular, onde os níveis de PGF2α começam a reduzir, comportamento essencial para a manifestação do cio na maioria dos mamíferos (Mccracken, 1999). Sua ação é mediada pela ligação ao receptor de membrana que é uma progeína G-ligadora denominada FPr. A síntese do FPr é estimulada pelo hormônio estrogênio. No final da fase luteolítica é observado um aumento no número de FPr no corpo lúteo, o que pode explicar a reduzida ação luteolítica do hormônio PGF2a no início da fase luteal (Mccracken, 1999). A expressão do gene STAR foi 2,32 vezes maior também nos animais de baixa prolificidade. Este gene codifica para uma proteína que regula a síntese de hormônios esteróides durante a luteinização antes da entrada no cio (Lavoie, et al 2004). A expressão do gene GATA foi 2,31 vezes maior nas fêmeas hipoprolíficas. Esse gene codifica para a proteína de ligação GATA-4 pertencentes a um grupo de fatores de transcrição responsáveis pela expressão de vários genes e a diferenciação de diversos tipos celulares. O CYP19 teve sua expressão relativa de 2,30 vezes a mais nas fêmeas de baixa prolificidade. Esse gene codifica para a enzima responsável pela biosíntese de estrogênio, a Citocromo Aromatase P450. Os folículos dominantes da célula da granulosa são a mais abundante fonte de estrogênio. Este hormônio tem seus níveis aumentados na fase folicular do ciclo estral com vistas a possibilitar a entrada no cio. Posteriormente após o surgimento do hormônio luteinizante (LH), é observado que o nível de estrogenio decresce assim como a expressão do CYP19 nos folículos pré-ovulatórios (Komar, et a.l 2001). O gene FSHR expressou 1,48 vezes a mais nos animais de alta prolificidade, aproximando-se do limiar estabelecido por este estudo para expressão diferencial (1,5). O FSH hormônio é um indutor do recrutamento folicular nos suínos e inibidor da apoptose das células da granulosa, isto o coloca como o melhor regulador da taxa de ovulação em suínos (Cárdenas & Pope, 2002). Li et al (2000), considerou o gene FSHβ como um major gene para tamanho de leitegada. Sites et al (1994), em estudos com culturas de células da granulosa de suínos afirmam que o FSH controla negativamente o FSHR, enquanto estimula a síntese do FSHR mRNA e a biosíntese de progesterona. A expressão dos
genes estudados pode estar sendo influenciada pela fase do ciclo reprodutivo
em que os animais foram analisados, a fase folicular do ciclo estral. Ou ainda esses genes podem ter regulação positiva
ou negativa dependendo do tecido e do estágio de desenvolvimento em que os
mesmos se encontram. Estudos que utilizam a metodologia de PCR quantitativo
em tempo real (qPCR) fazem
uso do cDNA (DNA complementar ao mRNA) para quantificação da expressão gênica. No entanto,
não se pode afirmar se os genes supramencionados estão expressando a mensagem
e a proteína (hormônio ou receptor), ou somente o mRNA. Ainda assim, há necessidade de se verificar
diferenças de expressão desses e de outros genes relacionados, durante as
demais fases do ciclo reprodutivo de suínas com vistas ao melhor entendimento
dos fenótipos produtivos em suínos. Referências: Bouchard P. Progesterone
and the progesterone receptor. J Reprod
Med., v.44 (2), p.153-157. 1999. Cárdenas, H.
& Pope, W. F. Control of ovulation rate in swine. J.Anim.Sci. v.80(1), p. 36-46. 2002. Komar, C. M. et al. Decline incirculating
estradiol during the periovulatory
period is correlated with decreases in estradiol andandrogen, and in messenger RNA for p450 aromatase and p450 17alpha-hydroxylase, in bovine preovulatory follicles. Biol. Reprod. v. 64, p.1797–1805. 2001. Lavoie, H.A.; Singh, D.; Hui, Y.Y. Concerted Regulation of the Porcine Steroidogenic Acute Regulatory Protein Gene Promoter
Activity by Follicle-Stimulating Hormone and nsulin-Like
Growth Factor I in Granulosa Cells Involves GATA-4
and CCAAT/ Enhancer Binding Protein. Endocrinology, v.145 (7),
p.3122–3134. 2004. Li, M.D.; Rohrer,
G.A.; Wise, T.H.; Ford, J.J. Identification and characterization of a new alele for the beta subuinit of follicule-stimulating hormone in Chinese pig breeds. Animal genetics,
v.31, p.28-30. 2000. Mccracken, J.A. Custer, E.E.; Lamsa, J.C. Luteolysis: A Neuroendocrine-Mediated Event. Physiological
reviews v.79 (2), p.263-324. 1999. Peralta, L.E.; Olarte,
M.R.; Argañaraz, M.; Ciocca,
D.; Sites, C.
K.; Patterson, K.; Jamison, C. S;
Degen, S. J. F.; Labarbera,
A.R. Follicle-stimulating hormone (FSH)
increases FSH receptor messenger
ribonucleic acid while
decreasing fsh binding
in cultured porcine
granulosa
cells. Endocrinology, v. 134(1). p. 411-417. 1994.
Ying, C.; Yang.,
Y-C.; Hong, W-F.; Cheng, W. T. K.; Hsu, W-L. Progesterone
receptor gene expressionin preimplantation
pig embyos. Journal of
Endocrinology, v.143, p.697-703. 2000. |
