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Programa de Pós Graduação em Genética
e Melhoramento Mesa Redonda Genômica no Melhoramento Prelecionistas: Cristiana Libardi Miranda Samuel Mazzinghy
Alvarenga Janaína Oliveira Melo Fernanda Abreu Santana Moderador: Prof. Sérgio
H. Brommonschenkel Genômica no Melhoramento A genômica é a ciência que estuda o genoma
dos organismos a partir do seu sequenciamento completo,
com o objetivo de entender a sua estrutura, organização e função. O sequenciamento do genoma de espécies animais, inclusive
do genoma humano, e vegetais tem fornecido
evidências para estudos de sintenia das funções
gênicas. Essa ciência divide-se em estrutural, funcional e comparativa. A genômica estrutural estuda a organização e
estrutura dos genes, analisando seqüências transcritas e estruturais por meio
de metodologias como marcadores de DNA e sequenciamento.
O estudo das funções gênicas cabe à genômica
funcional, que tenta compreender as mudanças no funcionamento do genoma em
diferentes estágios do desenvolvimento e sob diferentes condições ambientais.
Os estudos da função dos genes baseiam-se na construção de Bibliotecas de cDNA e em técnicas como Diferencial
Display Reverse Transcriptase
– PCR, Serial Analyses of
Gene Expression e Microarray
. Interligando e complementando esses dois estudos surge a genômica comparativa a qual busca conhecer as relações
entre genomas, a homologia entre seqüências e genes, determinando o grau de sintenia de espécies correlacionadas. Essas ferramentas moleculares proporcionam ao
Melhoramento Clássico um grande avanço na busca de indivíduos geneticamente
superiores por permitir que regiões ou genes que controlam características de
interesse.sejam identificados. O Melhoramento Assistido permite acompanhar a
variação fenotípica das características e a
localização de QTLs, genes
candidatos e genes de efeito maior.
Identificado o gene, é possível selecionar contra ou a favor do genótipo
pré-existente, ou obter novos genótipos por meio do silenciamento
ou da superexpressão de genes de interesse. Assim, a genômica surge
como uma ferramenta de grande importância para programas de melhoramento
genético. Bioinformática na Genômica A análise genômica
pode ser efetuada tanto em nível de DNA (genômica
estrutural), quanto de mRNA
(transcriptômica). Enquanto a primeira abordagem determina-se
a seqüência completa de um organismo, a segunda concentra-se na análise das
seqüências transcritas A primeira etapa de um projeto genoma consiste no sequenciamento do DNA total ou de cDNAs. O conjunto de clones provenientes de DNA genômico é chamado de Biblioteca genômica,
e a coleção de clones de cDNAs
obtidos a partir de mRNAs é chamada de Biblioteca
de cDNAs. As bibliotecas de cDNA podem ser construídas de acordo com o
interesse de cada pesquisador. Por exemplo, pode-se construir uma biblioteca
de algum tecido infectado por algum patógeno. Dessa
forma será possível identificar genes envolvidos em respostas de defesa, por
meio da análise das seqüências geradas a partir dessa biblioteca. Após o sequenciamento
é necessário fazer a retirada de contaminações, numa etapa chamada de trimagem, ou trimming. Seqüências de adaptadores, vetores, rRNAs e cauda poli-A são
excluídas das seqüências obtidas. Com as seqüências “limpas” prossegue-se
então para a fase de montagem dos fragmentos. Os reads (seqüências geradas pelo sequenciamento) são analisados por programas de bioinformática, que fazem cálculos de sobreposições,
montam os contigs
(seqüências consenso), melhoram a qualidade das seqüências e fecham os gaps (espaços
na seqüência). Depois de
remontar o genoma, é preciso dar um significado biológico para todas as
seqüências geradas. Nessa etapa, chamada de Anotação, é feita a comparação
das seqüências obtidas com seqüências depositadas em bancos de dados; a
identificação de fases abertas de leitura (ORFs); a análise de domínios protéicos na seqüência de aminoácidos deduzida a partir
da seqüência de bases; a identificação de regiões regulatórias;
o estabelecimento de relações filogenéticas entre a seqüência de interesse e
seqüências similares de outros organismos e a identificação e análise das
vias metabólicas com as quais a seqüência de interesse pode estar
relacionada. Para isso, existem várias ferramentas de bioinformática
disponíveis na internet de forma gratuita. Com as seqüências anotadas
pode-se avançar para a etapa de mineração de dados (Data Mining). Por meio desse processo é
possível selecionar, dentre todas as seqüências geradas pelo projeto genoma,
as seqüências possivelmente relacionadas com uma característica de interesse.
Posteriormente, é necessário fazer a confirmação das funções atribuídas aos
genes identificados com o auxílio de ferramentas da bioinformática.
Aqui começa a Genômica Funcional, que agrega
informações de regulação gênica e níveis de expressão aos dados já conhecidos
baseando principalmente em experimentos biológicos. Metodogias
Utilizadas A genômica
funcional estabelece as relações entre as seqüências de DNA e as
características fenotípicas do organismo. O acúmulo
de seqüências gênicas e genomas depositados em bancos de dados têm aumentado
a demanda por metodologias que permitam sua análise funcional. Dentre as
técnicas que podem ser utilizadas para uma análise mais eficiente e rápida de
um grande número de genes simultaneamente, destacam-se: Análise da Expressão
Diferenciada (Diferencial Display – DD), Análise Serial da Expressão Gênica
(Serial Analysis of Gene Expression
–SAGE) e Microarranjos de DNA (Microarrays). A técnica differential display (DDRT) foi desenvolvida em
1992 por Liang e Pardee
com o objetivo de comparar, identificar e isolar genes expressos em
determinadas condições em vários tipos de células eucarióticas. A metodologia
baseia-se na extração do RNA mensageiro (mRNA), obtenção do DNA complementar (cDNA) por meio da transcrição reversa utilizando primers oligo(dT) com uma ou duas bases
ancoradas. O cDNA obtido é
amplificado em uma reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) através de primers curtos
e aleatórios e utilizando desoxinucleotídeos
marcados radioativamente ou com fluorescência. A visualização do resultado da
amplificação geralmente é feita em gel de poliacrilamida
(quando a marcação é isotópica) ou em seqüenciadores automáticos (marcação
por fluorescência). Os resultados da DDRT podem ser confirmados através de Northern blot ou
clonagem dos cDNAs
diferencialmente expressos. A clonagem do cDNA é necessária para o porterior
sequenciamento e pesquisas em bancos de dados (Liang & Pardee, 1995). A Análise Serial da
Expressão Gênica (SAGE – Serial Analysis of Gene Expression) é um método
rápido e abrangente utilizado para a elucidação quantitativa da expressão
gênica. A tecnologia SAGE é baseada em dois princípios: primeiro, uma
seqüência curta – tag
(9-11 pb) contém informação suficiente para
identificar um transcrito único. Segundo, vários tags podem ser concatenados em uma
única molécula e seqüenciados, resultando na caracterização de muitos tags
simultaneamente. O padrão de expressão de qualquer população de transcritos
pode ser quantitativamente avaliado pela abundância dos transcritos e pela
identificação do gene correspondente a cada tag (Velculescu et
al., 1997). O microarray quantifica o transcriptoma de uma amostra de células comparando-as com
uma amostra referência, resultando numa medida funcional da expressão gênica
feita em um único experimento. O microarray corresponde
a um suporte de vidro (chip)
contendo milhares de clones de cDNA
ou oligonucleotídeos (sondas) roboticamente
imobilizados que podem ser escolhidas a partir de um banco de dados de ESTs ou de clones de cDNA
disponíveis comercialmente. A hibridização é feita com as bibliotecas de cDNA controle e teste marcadas,
cada uma com uma fluorescência diferente e a leitura feita por um scanner. Devido ao fato de ambas as
bibliotecas de cDNA serem
hibridizadas juntas, em um único chip, genes presentes em ambas as bibliotecas
competirão pela ligação à sonda. Portanto, a intensidade da fluorescência é
diretamente proporcional à quantidade do gene presente em uma amostra
comparada com a outra (Zachariah, G.G. & Dhanasekaran, N., 2004). As metodologias citadas
anteriormente têm sido aplicadas em análises transcricionais
em humanos, fungos, animais e plantas. A utilização dessas técnicas tem
contribuído para a análise global dos transcritos, o entendimento da
expressão gênica diferencial, a caracterização da transcrição em células ou
tecidos específicos ou em condições fisiológicas diversas (Torres et al., 2006; Matsumura et al., 1999; Whetten et al., 2001). Apesar da grande contribuição das
metodologias utilizadas na análise da genômica
funcional, vale ressaltar que todas elas apresentam limitações e vantagens,
considerando o custo da implementação, as dificuldades
de otimização, reprodutibilidade dos procedimentos laboratoriais, volume de
dados gerados, etc. Portanto, a utilização de uma técnica dependerá dos
objetivos da pesquisa e dos recursos disponíveis para sua implementação. Além
disso, uma técnica pode ser utilizada em complementação à outra (Stein & Liang, 2002). Marcadores moleculares na Genômica Uma grande aplicação dos projetos genoma é a
possibilidade de gerar novos marcadores moleculares que poderão ser de grande
utilidade em diversos programas de melhoramento. Os marcadores microssatélites e SNPs
(polimorfismos de uma única base, single nucleotide polymorphism)
têm sido beneficiados com a era genômica, uma vez
que o desenvolvimento e a identificação desses marcadores têm sido facilitado
pelo sequenciamento do DNA. Os microssatélites
substituíram outros marcadores em diversos estudos genéticos, principalmente
devido a sua alta reprodutibilidade, expressão codominante
e multialelismo. Os projetos de sequenciamento de genomas tem ampliado a
possibilidade de desenvolvimento desses marcadores. Por meio da análise das
seqüências depositadas é possível a identificação de microsatélites e o desenho dos primers de uma maneira muito
mais rápida e eficiente quando comparada com a estratégia tradicional.
Atualmente, os microssatélites têm sido amplamente
utilizados para construção de mapas genéticos, estudos de diversidade e sintenia e seleção assistida (BAO et
al., 2006). Os SNPs
são as variações mais freqüentes no genoma de qualquer organismo e
correspondem a posições do DNA onde existe uma alternância dos nucleotídeos,
em uma freqüência alélica mínima de 1% em uma dada
população (BROOKES, 1999). Estes marcadores podem ser inicialmente
identificados in silico,
explorando bancos de dados públicos contendo informações de vários organismos
(htpp://www.ncbi.nlm.nih.gov/) com o auxílio de ferramentas da bioinformática. Após a identificação dos SNPs, há a necessidade da validação
dos dados e estudos de associação para se avaliar o potencial informativo de cada polimorfismo. A genotipagem dos SNPs
não se baseia no tamanho dos fragmentos dos alelos, e para a distinção dos
mesmos podem ser utilizadas várias técnicas que exigem um grande
investimento. O grande interesse na utilização do SNPs é que eles podem ser utilizados na análise de
genes e na associação com características de interesse econômico da espécie.
Segundo USECHE et al. (2001) os SNPs possuem grande potencial para a aplicação no
melhoramento. Referências: BAO,
J. S., CORKE, H. AND SUN, M. (2006). Microsatellites,
single nucleotide polymorphisms and a sequence tagged site in
starch-synthesizing genes in relation to starch physicochemical properties in
nonwaxy rice (Oryza
sativa L.). Theor Appl
Genet, 113:1185–1196. BROOKES, A.J. (1999).
The essence of SNPs. Gene, 234(2):177-186. LIANG,
P. & PARDEE, A.B. (1992). Differential Display of eukaryotic messenger RNA by
means of the polymerase chain reaction. Science, 257: 967-971. LIANG,
P. & PARDEE, A.B. (1995). Recent advances in differential display. Current Opinion in
Immunology, 7: 274-280. MATSUMURA, H.,
NIRASAWA, S. AND TERAUCHI, R. (1999). Transcript profiling
in rice (Oryza sativa L.) seedlings using serial
analysis of gene expression (SAGE). The Plant Journal, 20(6): 719-726. STEIN,
J. & LIANG, P. (2002). Differential Display technology: a general guide. Cellular Molecular
Life Science, 59: 1235-1240. TORRES,
G.A.M., PFLIEGER, S., CORRE-MENGUY, F., MAZUBERT, C., HARTMANN, C. AND
LELANDAIS-BRIÈRE, C. (2006). Identification of novel drought-related mRNAs in common beans roots
by differential display RT-PCR. Plant Science, 171: 300-307. USECHE,
F., GAO, G., HARAFEY, M. AND RAFALSKI, A. (2001). High-throuphput
identification, database storage and analysis of SNPs
in EST sequence. Genome Informatics, 12:194-203. VELCULESCU, V.E.,
ZHANG, L., ZHOU, W., VOGELSTEIN, J., BASRAI, M.A., BASSETT JR, D.E., HIETER,
I.P., VOLGESTEIN, B. AND KINZLER, K.W. (1997). Characterization
of the Yeast Transcriptome. Cell, 88:
243-251. WHETTEN,
R., SUN, Y.H., ZHANG, Y. AND SEDEROFF, R. (2001). Functional
genomics and cell wall biosynthesis in loblolly pine. Plant Molecular
Biology, 47: 275-291. ZACHARIAH, G.G. & DHANASEKARAN, N. (2004). The Microrevolution: Applications and Impacts of Microarray Technology on Molecular Biology and Medicine. International Journal of Molecular Medicine, 13: 483-495. |
