Universidade Federal de Viçosa

Programa de Pós Graduação em Genética e Melhoramento

Seminário de Tese

Prelecionista: Maurecilne Lemes da Silva

Embriogênese somática, produção de sementes sintéticas e transformação genética de maracujá (Passiflora cincinnata Masters) mediada pela técnica de SAAT.

O presente trabalho teve como objetivos a proposição de protocolos para a indução de embriogênese somática primária e repetitiva a partir de anteras e embriões zigóticos, a produção de sementes sintéticas e a obtenção de plantas geneticamente modificadas mediada por A. tumefaciens e pela técnica de SAAT a partir de embriões somáticos de Passiflora cincinnata Mast. Da avaliação de diferentes estágios de desenvolvimento de botões florais (E1-E5), anteras provenientes apenas de estágios mais jovens (E1 a E3) apresentaram respostas morfogênicas em baixa freqüência, culminando com a formação de calos embriogênicos, e posterior diferenciação de embriões somáticos primários, somente nos calos derivados das anteras no estágio E2, quando cultivadas em meio MS em presença de 4,4 μM de 2,4-D e 2,3 μM de BAP. A suplementação do meio com carvão ativado e maltose, na ausência de reguladores de crescimento, promoveu a embriogênese somática indireta primária. Apesar da baixa eficiência na resposta embriogênica primária, houve intensa proliferação de embriões via embriogênese repetitiva. A utilização de fita Micropore na vedação das placas proporcionou maior aeração e maior perda de água do meio de cultura, funcionando possivelmente como um mecanismo de estresse no cultivo das anteras com melhor resposta calogênica. A análise histológica dos embriões secundários revelou sucessivas divisões mitóticas e progressivo processo de celularização. O sistema vascular nos embriões secundários é fechado com ausência de conexão com o explante de origem. Nos testes histoquímicos foi detectada a presença de grãos de amido, dispersos no parênquima cortical dos embriões somáticos secundários, em estágio cotiledonar, o início da lignificação das paredes das células do sistema vascular e deposição de substâncias fenólicas. Os embriões zigóticos cultivados em diferentes concentrações 2,4-D e 2,3 μM de BAP, após 30 dias de cultivo, apresentaram efetiva calogênese. As linhagens de células embriogênicas apresentaram-se pequenas e arredondadas, morfologicamente constituídas de núcleo volumoso e conteúdo citoplasmático denso, ao passo que as não embriogênicas eram alongadas, com núcleos pequenos e citoplasma menos denso. A concentração de 8,8 μM de 2,4-D resultou em maior número médio de embriões somáticos. As anormalidades nos embriões somáticos observadas foram os com o eixo fundido, com cotilédones fundidos e os embriões policotiledonares, estes com maior incidência. O sistema embriogenético repetitivo de P. cincinnata caracterizou-se pela intensa proliferação e manutenção da capacidade embriogenética por subcultivos sucessivos. Embriões zigóticos e embriões somáticos, estes derivados de embriões zigóticos foram utilizados na produção de sementes sintéticas em várias formas de cultivo. A produção de sementes sintéticas possibilita o estabelecimento de um protocolo alternativo de propagação para a espécie P. cincinnata bem como, trabalhos futuros fundamentados pela utilização do protocolo proposto em bancos de germoplasmas mantidos via criopreservação. Nos experimentos de transformação genética de P. cincinnata, no estabelecimento da curva de sobrevivência dos embriões somáticos, utilizados como explantes, ao antibiótico higromicina, observou que, a concentração de 6 mg L^-1 de higromicina foi inibitória à morfogênese. A utilização da técnica de SAAT resultou em benefícios na freqüência de transformação genética de embriões somáticos com a bactéria LBA4404 contendo o plasmídeo pCambia 1304. Após recultivos quinzenais em meios seletivos, ao final de 60 dias, os embriões diferenciados pela embriogênese repetitiva foram transferidos para meio de alongamento e conversão na presença de 1,7 mM de GA_3, regenerando-se 171 plântulas in vitro. Anteriormente ao processo de aclimatizaação ex vitro das plantas, avaliou-se a expressão de gus em folhas recém-expandidas, com freqüência de 7,6 % (SAAT 15’), 8,8 % (SAAT 30’) e 1,8 % (S/SAAT 30’). A análise molecular mediante reações de PCR, utilizando-se dos primers higromicina e NOS, confirmou a transgenia das plantas. A análise de citometria de fluxo revelou que as amostras S/SAAT 30’, SAAT 15’ e SAAT 30’ possuem conteúdo 2C de DNA, e uma planta poliploidizada com conteúdo de DNA aumentado em SAAT 30’. A curva de calibração para a análise via RT-PCR utilizando-se do plasmídeo pCambia 1304, apresentou um R² de 0,9974. Os números de cópias do transgene identificados a partir do alvo de amplificação 35S, considerando o valor 2C de DNA foram: SAAT 15’ e SAAt 30’ (6 cópias); S/SAAT (2 cópias) e planta poliploidizada SAAT 30’ (16 cópias). A análise histológica de plantas transgênicas mantidas em casa de vegetação, revelou padrões de expressão típicos dos genes gus e gfp.

Referências

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