GENÉTICA MOLECULAR

Tópicos

Identificação do material genético

DNA e RNA

Função do material genético

Bases fisiológicas da dominância e recessividade

Código genético

Síntese de cadeia polipeptídica

IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO


Em 1866 Mendel descreveu os genes através dos seus efeitos finais tais como os fenótipos. Pelos experimentos de Mendel, e de outros pesquisadores, ficou definido que os genes levam a informação genética de uma geração para outra e, apesar de não ser visto ou delimitado fisicamente, deveriam apresentar as seguintes propriedades:

- Replicação: processo que permite ao gene produzir outras unidades iguais a si próprio.

- Transcrição: Processo pelo qual a informação genética, é transferida para o local apropriado (ribossomo) e é traduzido.

- Tradução: Processo pelo qual são produzidas as proteínas a partir de uma seqüência de nucleotídeos.

Após Mendel, os genes foram definidos quimicamente e foram conhecidos pelo que realizam na síntese protéica e não a nível de expressão fenotípica.

Miescher (1869-71) publicou metodologia, que permite separar o núcleo do citoplasma. Do núcleo ele extraiu uma substância denominada nucleína, hoje conhecida por ácido nucléico, que se caracterizava por ter alta acidez, apresentava grande quantidade de fósforo e não continha enxofre.

Mais tarde descobriram que a nucleína estava associada, a vários tipos de proteínas formando a nucleoproteínas.

Da porção protéica foi constatado dois tipos de proteínas:

a. Protaminas: Proteína de estrutura simples, consistindo na maioria das vezes de grupos do aminoácido arginina. Esta proteína está presente no esperma de peixes e aves.

b. Histona: Proteínas relativamente complexas de ocorrência mais ampla.

Embora os peixes e as aves não sejam as mais complexas das criaturas parece difícil aceitar a idéia de que o material genético destes organismos seja a protamina. Ela, constituída quase apenas de arginina, não deveria ser capaz de originar os outros 20 aminoácidos conhecidos. Também é pouco aceitável que o material genético seja a histona, até a formação de uma protamina.

Griffith (1928) apresentou as primeiras evidências de que o DNA é o material genético. As evidências surgiram em experimentos realizados com bactérias do gênero Pneumococus. Muitas linhagens ou tipos de pneumococus (Diplococcus pneumoniae) podem ser distinguidos por diversas características:

Caracterização	Virulenta	Avirulenta
Colônia	Lisa (S)	Rugosa (R)
Capa protéica	Presente	Presente

O experimento realizado por Griffith é resumido a seguir:

Tratamento	Resultado
· Tipo II R injetado em ratos	ratos sobreviveram
· Tipo III S morto pelo calor injetado em rato	ratos sobreviveram
· Tipo III S morto pelo calor mais o tipo II R injetado em ratos	ratos morreram

A mudança não poderia ter surgida por mutação pois um mutante deveria ser da mesma linhagem genética do tipo III, entretanto foi o tipo II (com capa protéica) que adquiriu a propriedade de causar a doença tal como o tipo III. Algum fator das bactérias do tipo III S estava aparentemente sendo transferido para os cocus vivos (tipo II) de tal forma que o tipo II avirulento, transformara-se em cocus virulentos. Este fenômeno foi conhecido como "efeito Griffith" ou "transformação".

Avery, MacLeod e McCarty (1944) publicaram resultados de extensas investigações durante um período de 10 anos. Ele fizeram, em condições de laboratório, experimentos semelhante ao de Griffith. Avery et al relataram que ao colocar em um tubo de ensaio bactérias II R (avirulenta), extrato de DNA do tipo III S (virulenta) mortas pelo calor e soro que precipitava as bactérias do tipo II R, foram recuperadas as colônias de bactérias do tipo III S. Estes experimentos identificaram o DNA como material genético. Assim, quando o DNA extraído de uma linhagem é introduzido em células de outra linhagem, os organismos receptores desenvolveram características da linhagem doadora. Desta forma, conclui-se que:

- O DNA é o material genético em D. pneumoniae.

- O DNA atua como agente que especifica produção de um produto final.





DNA E RNA


Constituição química do DNA e RNA

Quando o ácido nucléico foi separado da proteína muitos pesquisadores, especialmente Levene, mostraram que ele poderia ser quebrado em pequenas partes denominadas de nucleotídeos. Cada nucleotídeo contém:

Caracterização	DNA	RNA
1. Açúcar	Desoxiribose	Ribose
2. Grupo Fosfatro	H3PO4	H3PO4
3. Bases nitrogenadas	Piridiminas: Citosinas e Timinas Purinas Adenina e Guanina	Piridiminas: Citosinas e Uracil Purinas Adenina e Guanina

Chargaff, em seus estudos, apresentou várias informações a respeito da molécula de DNA. Identificou-se que ocorre ligações entre a pirimidina citosina e purina guanina e entre a pirimidina timina e a purina adenina. As ligações envolvem duas pontes ente A e T e três entre G e C. Também constatou a seguinte relação:

(C+A)/(G+T) =1

Diferenças entre DNA e RNA

O DNA se diferencia do RNA nos seguintes aspectos:

a. O açúcar do DNA é a desoxiribose enquanto que o do RNA é a ribose.

b. O DNA contém a timina e o RNA a uracil.

c. O DNA é um filamento duplo e o RNA é um monofilamento.

d. O DNA apresenta uma molécula longa e o RNA uma molécula curta

Modelo do DNA segundo Watson e Crick

Watson e Crick propuseram um modelo de DNA cujos princípios físicos derivaram das figuras de difração de raios X produzidas por Wilkins e Astracan, usando DNA isolado. Os princípios químicos derivaram principalmente dos trabalhos apresentados por Chargaff e seus associados.

Segundo Watson e Crick, o DNA apresenta as seguintes características:

a. O DNA é uma hélice dupla helicoidal.

b. O enrolamento da hélice é para a direita.

c. Os longos filamentos externos relativamente rígidos, são constituídos de fósforo (P) e açúcar (A).

d. No sentido transversal os filamentos menos rígidos são constituídos por bases orgânicas (purinas e pirimidinas) unidas, por pontes de hidrogênio.

e. O comprimento de uma volta completa, na espiral envolve cerca de 10 nucleotídeos (34 angstron)

Associação entre DNA e Histonas

As histonas formam um complexo juntamente com os grupos fosfatados do DNA carregados negativamente. As histonas são carregadas positivamente, sendo conhecidas por "proteínas básicas". As cargas positivas são fornecidas por uma alta proporção de aminoácidos lisina e arginina. Algumas histonas são denominadas "rica. em lisina" e outras "ricas em arginina".

Em geral são encontradas somente nos organismos em que a diferenciação celular ocorre (eucariotas). São distinguidos, em função da proporção lisina/arginina, cinco diferentes tipos de histonas (H1, 2 H2A, 2 H2B e 2 H3).

A complexação das histonas além de causar um aumento do diâmetro do DNA, de cerca de 20 a 30 angstron, muda também as propriedades físicas do DNA. A temperatura de fusão (temperatura na qual os fios de DNA mudam da forma de hélice dupla regular para a forma de fio simples) é bastante aumentada.





Replicação do material genético

O modelo de replicação do DNA é dito ser semi-conservativo, ou seja, uma fita de DNA dá origem a outras duas sendo que, cada uma delas apresenta um filamento da fita original.

A replicação ocorre na intérfase da divisão celular e é dirigida pela enzima DNA polimerase. Na replicação as pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas se rompem e a enzima DNA polimerase cataliza a adição de novos nucleotídeos complementares às bases expostas de tal maneira que duas novas fitas de DNA sejam formadas. .

O RNA - Ácido ribonucléico

O RNA é encontrado tanto no núcleo quanto no citoplasma. Tem sido reconhecido vários tipos de RNA:

a. RNA mensageiro - mRNA

É o RNA envolvido pela transcrição da informação genética contida no DNA, no núcleo, e condução da mesma até os sítios ribossômicos.

b. RNA transportador - tRNA

Caracteriza-se por ser um RNA pequeno, contendo cerca de 75 a 85 nucleotídeos e por assumir uma forma de trevo. Sua função principal é a de conduzir os aminoácidos requeridos na síntese protéica até as subunidades do ribossomo.

c. RNA ribossômico - rRNA

Entra na composição do Ribossomo. Sua função não é bem definida.





FUNÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO


Garrod (1900), médico inglês, deu os primeiros passos para evidenciar a ação dos genes. Este pesquisador estudou a alcaptonúria, uma doença hereditária caracterizada pela coloração escura na urina. Para esta doença foi observado que o escurecimento era conseqüência do acúmulo de ácido homozentízico (alcapton) o qual, nos indivíduos normais, era decomposto através de reações enzimáticas, de tal maneira que havia excreção de ácido acético. Constatou-se ainda que dietas com tirozina e fenilalamina aumentava a manifestação de sintomas.

Os trabalhos decisivos sobre a função do gene foram apresentados por Beadle e Tatum que propuseram a teoria "um gene - uma enzima". As idéias principais do trabalho realizado por estes autores foram:

a. Todos os processos bioquímicos dos organismos estão sob controle genético.

b. Os processos bioquímicos ocorrem numa seqüência de reações individuais.

c. Cada reação simples é controlada por um gene simples.

d. Cada gene atua através do controle e produção de uma enzima específica.

Na atualidade esta teoria apresenta as seguinte falhas:

a. Um gene pode especificar a síntese de uma cadeia polipeptídica que não apresenta nenhuma função enzimática (Ex.: Hemoglobina).

b. Uma enzima pode ser constituída por mais de uma cadeia polipeptídica (Ex.: RNA polimerase é constituída por várias cadeias e, consequentemente, esta sob o controle de vários genes.

c. Um gene pode controlar a atividade de uma enzima especificada por outro gene (Ex.: sítio operadores, repressores, etc.).





BASES FISIOLÓGICAS DA DOMINÂNCIA E RECESSIVIDADE


De acordo com a teoria "um gene - uma enzima" os genes agem através da produção de enzimas, sendo que cada gene é responsável pela produção de uma enzima específica. Por este princípio podemos explicar as bases fisiológicas da dominância e recessividade segundo uma determinada via biossintética. Assim, tem-se:

Dominância completa

Neste caso a quantidade de enzimas produzidas pelo heterozigoto Aa, embora geralmente menor que a produzida pelo homozigoto AA, é suficiente para produção do mesmo produto final de AA.

Dominância. incompleta

Neste caso a menor quantidade de enzimas normal produzida pelo heterozigoto Aa, em relação ao homozigoto AA, resulta em uma menor quantidade de produto final que pelo efeito de dosagem confere um fenótipo diferente do produzido pelo homozigoto AA.

Codominância

Neste caso o complexo enzimático produzido por Aa, dado a contribuição de A e de a, é diferente da enzima produzida por AA e consequentemente o produto final será diferente daquele produzido por AA. Neste caso a qualidade de enzima é o fator crítico.





CÓDIGO GENÉTICO




Definição de código genético

Sabe-se que o DNA, que se encontra no núcleo, tem a função de produzir proteínas cuja síntese ocorre no núcleo. O DNA é uma seqüência de nucleotídeos e que existe apenas quatro tipos diferentes de nucleotídeos: os nucleotídeos da adenina, da guanina, de timina e da citosina. Por outro lado, as proteínas são polímero de subunidades (monômeros) denominadas de aminoácidos. Cada aminoácido engloba um grupo amino (NH2) numa extremidade e um grupo carboxila (COOH) na outra. Vinte tipos diferentes de aminoácidos ocorrem nas proteínas.

Diante do exposto surge a seguinte pergunta: quantos nucleotídeos seriam necessários para codificar um aminoácido? Para responder a esta perguntas é necessário o seguinte raciocínio matemático:

- Se 1 nucleotídeo codificasse um aminoácido só poderia existir 4 diferentes tipos de aminoácidos na cadeia protéica.

- Se 2 nucleotídeos codificassem um aminoácido só poderia existir 16 tipos de aminoácidos diferentes na cadeia protéica.

- Se 3 aminoácidos codificassem um aminoácido seria possível existir 64 tipos diferentes de aminoácidos na cadeia protéica logo, por matemática, um código tríplice é a menor unidade de codificação capaz de acomodar os 20 diferentes tipos de aminoácidos que comumente ocorrem nas proteínas.

Atualmente definimos o CODON como sendo uma seqüência de três nucleotídeos adjacentes no mRNA capaz de codificar um aminoácido.

Decifração do código genético

Estudos foram realizados permitindo constatar que o código genético representado por sessenta e quatro codons mRNA, sessenta e um dos quais codificam para aminoácidos e três para terminação em cadeia. Três dos que codificam aminoácidos são identificados também como iniciadores.

São evidenciadas as seguintes características do código genético:

Código genético redundante ou degenerado

O código genético é dito degenerado pelo fato de existir, para um determinado aminoácido, mais de uma trinca para codificá-lo. Apenas a metionina (Met) e o triptofano (Trp) são codificados por um único codon, representados por AUG e UGG, respectivamente.

A glicina (GLY), por exemplo, é codificada por GGG, GGC, GGA e GGU.

Trincas sem sentido ou terminalizadoras

São aquelas trincas que não codificam aminoácidos e que tem por função indicar o término da síntese protéica. São também denominados trincas terminalizadoras. Ex.: UAG, UAA, UGA.

Código genético universal

O código genético é dito universal devido ao fato da mesma trinca codificar o mesmo aminoácido em qualquer organismo. Em alguns casos certas trincas são mais eficientemente utilizadas.





SÍNTESE DE CADEIA POLIPEPTÍDICA


A síntese protéica envolve as seguintes etapas: Transcrição e Tradução

Transcrições

Processo que ocorre no núcleo da célula, no qual a mensagem genética é passada do DNA para uma fita de mRNA, com auxílio da ação catalítica da enzima RNA polimerase.

A informação do DNA é transcrita em uma seqüência codificada do mRNA, através do uso, com gabarito, de um filamento do DNA. Até hoje, o mecanismo de seleção do filamento apropriado ainda é desconhecido.

O mRNA transcrito solta-se do modelo de DNA e desloca-se do núcleo para o citoplasma. Após o mRNA se desacoplar, as pontes de hidrogênio que haviam-se desfeitas voltam-se a ligar.

A enzima RNA polimerase tem as seguintes funções:

a. Reconhecer as bases do DNA.

b. Selecionar os ribonucleotídeos apropriados.

c. Catalizam a formação de ligações entre os ribonucleotídeos.

d. Escolhe o filamento correto a ser transcrito.

A RNA polimerase é constituída de 6 cadeias polipeptídicas (2 alfa, beta, beta', gama e sigma), sendo que o fator sigma é o responsável pela transcrição no local e fio correto.

Tradução

A tradução é um processo que ocorre no citoplasma da célula, no qual a mensagem trazida pela fita de mRNA é traduzida em uma seqüência de aminoácidos.

O processo de tradução envolve as seguintes etapas:

a. Após a chegada da fita de mRNA no citoplasma, ocorre a complexação das subunidades do ribossomo (nos procariotas o ribossomo é 70 s = 50 s + 30 s, e nos eucariotas é de 80 s = 50 s + 40 s) com esta fita. Polissomos é a denominação que se dá à complexação de vários ribossomos a uma mesma fita de mRNA. No caso da síntese da hemoglobina, os ribossomos reunem-se em 4 ou 5 polissomos.

b. É iniciado a leitura e tradução da fita de mRNA. Nos procariotas, em geral, a primeira trinca a ser lida (fator de inicialização) é a AUG, que corresponde à metionina formilada (As trincas GUU, GUC, GUA e GUG que corresponde à metionina formilada (as trincas GU, GUC, GUA, GUG, que corresponde à valina também são fatores iniciadores), enquanto que nos eucariotas o primeiro aminoácido é também a metionina mas não formilada. Nem todas as proteínas iniciam com a metionina (ou valina) e isto se dá pelo fato da proteína final ser o resultado de uma reestruturação, incluindo quebras, da estrutura linear de aminoácido.

Após a leitura da trinca ocorre a transferência do aminoácido requerido para os sítios ribossômicos. Este transporte é realizado pelo tRNA. No tRNA é encontrado o anti-codon, que é uma seqüência de três bases adjacentes complementares ao codon do mRNA.

c. O tRNA penetrando por uma abertura da subunidade 50S, ocupa o sítio aminoacil. Pela ação da enzima translocase o tRNA ativado passa para o sítio peptidil, permitindo a leitura, pelo complexo ribossomo-mRNA, da trinca consecutiva.

d. Após a leitura da nova trinca um novo tRNA é ativado e deslocado do suco citoplasmático para o sítio aminoacil do complexo levando o aminoácido requerido pela proteína.

e. Pela ação da enzima peptidil transferase o aminoácido (ou seqüência de aminoácidos) que pertencia ao tRNA do sítio peptidil é transferido e ligado ao aminoácido acoplado ao tRNA do sítio aminoacil.

f. O tRNA desativado, que ocupa o sítio peptidil, deixa o complexo ribossomo-mRNA podendo ser novamente ativado quando se fizer necessário.

g. Novamente, pela ação da enzima translocase, o tRNA ativado passa do sítio aminoacil para o sítio peptidil permitindo a leitura de uma nova trinca. A leitura da nova trinca implica em ativação de um outro tRNA.

h. O processo é continuado até que todos os aminoácidos necessários para a confecção da proteína estejam ligados. A última trinca lida na fita de mRNA deverá ser um fator de terminalização (UAA, UAG ou UGA) que não codifica nenhum aminoácido mas indica o término da síntese protéica.

i. A síntese protéica termina com a desativação do complexo ribossomo-mRNA, a desativação do tRNA e formação da proteína que ainda se encontra em forma linear. Para adquirir a especificidade é necessário que esta estrutura primária atinja uma estrutura terciária ou quaternária.