UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E MELHORAMENTO

SEMINÁRIO DE TEMA LIVRE

Avaliação da Expressão gênica diferencial e dos hidrocarbonetos cuticulares de RAINHAS, operárias, machos haplóides e diplóides de Melipona quadrifasciata (Hymenoptera: Apidae)

Prelecionista: Andreia Arantes Borges

Orientadora: Profª Mara Garcia Tavares

Data: 17-06-2010

RESUMO

Em Melipona quadrifasciata, assim como na maioria dos Hymenoptera, ovos fertilizados dão origem a fêmeas, ovos não fertilizados originam machos haplóides e ovos fertilizados que apresentam homozigose no loco da determinação sexual se desenvolvem em machos diplóides (Whiting, 1939).

A fim de compreender os mecanismos moleculares envolvidos nos processos de diferenciação dos machos foi empregada a técnica de RDA (Hubank e Schatz, 2000), para identificar genes diferencialmente expressos. Amostras de indivíduos recém-emergidos destes machos foram utilizadas para a construção das bibliotecas subtrativas. As ESTs validadas apresentaram alta qualidade (83,3% para machos 2n e 86,7% para machos n). Posteriormente, as ESTs foram submetidas a análises CAP3 gerando 30 contigs e 88 singlets. Análises BLAST revelaram similaridades, com genes de Apis mellifera, de outros meliponíneos e de Drosophila melanogaster. Adicionalmente, algumas ESTs não apresentaram similaridade com sequências depositadas nos bancos de dados. Informações funcionais relativas aos genes ortólogos de Drosophila e com similaridades a sequências de abelhas foram atribuídas por meio do Gene Ontology. A análise comparativa da expressão gênica destes machos revelou que os machos haplóides expressam genes envolvidos nos processos reprodutivos, de espermatogênese e de resposta a estímulos químicos, enquanto que a maioria dos genes expressos nos machos diplóides está envolvida com transporte intracelular de íons, localização celular, desenvolvimento tecidual e atividade hidrolítica. A ausência de transcritos relacionados com processos reprodutivos nos 2n pode explicar a sua esterilidade e menor fitness.

A expressão gênica de rainhas, operárias, machos haplóides e diplóides de M. quadrifasciata, recém-emergidos e com cinco dias de idade adulta foi quantificada utilizando 10 genes casta-específicos. O método comparativo Ct (Pfaffl, 2001) foi empregado para análise da expressão gênica relativa utilizando os genes rp49 e actina como controles endógenos. As maiores diferenças foram observadas entre machos diplóides e rainhas, em que seis (na fase de recém-emergidos) e nove (na fase de cinco de dias de idade adulta) dos dez genes analisados mostraram-se estatisticamente diferentes, com a maioria dos genes dos machos diplóides sendo superexpressos em relação aos de rainhas (p<0,05). Os níveis de expressão gênica dos machos 2n recém-emergidos mostraram-se mais similares aos de operárias que aos de machos n e rainhas. Tal similaridade mostrou-se mais acentuada, ao atingir cinco dias de idade, onde diferenças de expressão estatisticamente significativas foram encontradas apenas para os genes Mq1, Mq3 e Mq5 (p<0,05). Estes resultados corroboram os dados de que a diferença entre machos diplóides e operárias pode estar associada a homozigose do loco sexual nos machos diplóides.

Outra abordagem que merece destaque no estudo destas abelhas é o perfil dos hidrocarbonetos cuticulares. A caracterização da composição química cuticular dos integrantes de uma colônia foi realizada utilizando-se as asas de machos 2n e n (ambos, N=9 colônias), rainhas (N=4) e operárias (N=12), todos recém-emergidos. A extração dos compostos presentes em um pool de sete a dez pares de asas ocorreu por meio de banhos em hexano por um minuto e os extratos foram analisados em um sistema de cromatografia gasosa-espectrometria de massa. A composição química variou quantitativa e qualitativamente entre os fenótipos. Os compostos C23, C25, 7-Me-C25, Z-C31 contribuiram significativamente para a discriminação dos machos haplóides e diplóides. A análise estatística multivariada mostrou os fatores 1 e 2 da análise de componentes principais explicam 52,31% da variação total entre os fenótipos. A análise discriminante stepwise dos compostos analisados separou significativamente as rainhas dos demais fenótipos, conforme demonstrado pelas distâncias de Mahalanobis (Rainha X Macho 2n = 39,32; Rainha X Macho n = 37,40; Rainha X Operária = 30,74), sendo os compostos C23, Z-C25 e 7-Me-C27 os responsáveis por esta separação. Além disso, o padrão de hidrocarbonetos cuticulares dos machos 2n mostrou-se mais similar ao padrão de operárias do que ao de machos n (Distância de Mahalanobis de 7,19 e 8,89, respectivamente). Estes resultados corroboram os dados de que o perfil químico de operárias e machos é diferente daquele de rainhas reforçando as diferenças morfológicas e comportamentais existentes entre estes fenótipos em diferentes espécies de meliponíneos (Kerr et al., 2004; Pianaro et al., 2006). A análise dos padrões de hidrocarbonetos cuticulares confirmou os dados da expressão gênica em que se observou maior similaridade entre machos 2n e operárias.

O estudo dos machos diplóides é de interesse especial para o entendimento da biologia reprodutiva das espécies pertencentes a ordem Hymenoptera, podendo contribuir para o entendimento dos mecanismos genéticos da determinação do sexo destes organismos.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

KERR, W.E., JUNGNICKEL, H., MORGAN, E.D. (2004). Workers of the stingless bee Melipona scutellaris are more similar to males than to queens in their cuticular compounds. Apidologie 35:611-618.

HUBANK, M., SCHATZ, D.G. (2000). Representational difference analysis of cDNA. Functional Genomics 45-80.

PFAFFL, M.W. (2001). A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research 29: 2004-2007.

PIANARO, A., SINGER, R.B., MENEZES, C., MARSAIOLI, A. (2006). Estudo Químico de Operárias e Machos de Nannotrigona testaceicornis e Plebeia droryana (Apidae: Meliponinae). 29ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. Águas de Lindóia – SP.

WHITING, P.W. (1939). Sex determination and reproductive economy in Habrobracon. Genetics 24:110-111.

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Andreia Arantes Borges Profª. Mara Garcia Tavares

Estudante Orientadora