MAPEAMENTO
GENÉTICO
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Produção: Laboratório de Bioinformática
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Aplicativo suporte: Programa
GBOL – Genética Básica on line
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Comunidade (facebook): GbolNews
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Relação entre Mapa Genético e Físico
O mapa genético de uma espécie é
um modelo abstrato do arranjo linear de um grupo de genes ou marcadores (veja o
exemplo do mapa genético do cacaueiro). Para
a construção de um mapa de ligação é necessário que os genes ou marcadores
sejam de herança simples. As seguintes etapas devem ser seguidas para a
construção de um mapa de ligação ou mapa genético:
- Fazer teste de segregação de cada marca, constatando
que as proporções estão dentro de valores esperados para a população de
trabalho.
-Estimar a freqüência
de recombinação entre pares de marcadores.
-Agrupar os marcadores em
diferentes grupos de ligação.
-Definir a ordem dos marcadores
em cada grupo de ligação.
-Estimar a freqüência
de recombinação multiponto entre marcadores adjacentes.
Mapas físicos podem ser obtidos a
partir das técnicas de bandeamento cromossômico e hibridização in-situ (mapa citogenético); pelo
ordenamento de fragmentos de restrição (mapa de restrição) ou pelo seqüenciamento do genoma.
RELAÇÃO ENTRE MAPA GENÉTICO E
MAPA FÍSICO
Tanto o mapa genético pode ser
utilizado para aumentar a resolução de mapas físicos, como mapas físicos podem
ser utilizados para aumentar a resolução de mapas genéticos. Quando comparados,
ambos devem refletir a mesma estrutura genômica, ou seja, a ordem dos
marcadores deve ser a mesma (embora a distância possa variar de um mapa para
outro). A informação combinada dos dois tipos de mapa é a chave para a clonagem
de genes. Considerando um gene flanqueado por dois marcadores moleculares, para
se chegar a seqüência do gene partindo dos
marcadores, centenas de milhares de pb
deverão ser seqüenciadas até se chegar ao gene. Se
por outro lado for feito o mapeamento físico da região flanqueada pelos
marcadores moleculares, é possível identificar os clones que contém partes do
gene (pela distância estimada entre os marcadores e o gene) e seqüenciar apenas estes clones.
Para
o mapeamento genético de plantas, diversos tipos de populações podem ser utilizadas, cada uma com características próprias,
apresentando vantagens e desvantagens que devem ser levadas em consideração
pelo pesquisador no memento da escolha. A escolha da população deve levar em
conta os objetivos a que se propõe o pesquisador, além do tempo disponível para
a execução do trabalho, e dos recursos disponíveis. As populações de mapeamento
com o maior conteúdo de informação são aquelas obtidas a partir do cruzamento
entre dois indivíduos homozigotos contrastantes. Nas plantas F1
obtidas, o desequilibrio de ligação é máximo, e as
populações derivadas a partir destas plantas F1 procuram explorar
este desequiliíbrio.
-Populações F2: obtidas por autofecundação das plantas F1
obtidas do cruzamento entre parentais endogâmicos.
Nestas populações, os marcadores co-dominantes
segregam na proporção 1:2:1, e os marcadores dominantes segregam na proporção
3:1. Populações híbridas, oriundas do cruzamento entre parentais heterozigotos
também podem ser analisadas com F2, desde que os marcadores
segreguem na proporção esperada.
-Populações derivadas por autofecundação a partir da geração F2. Em programas de
melhoramento genético de plantas, são comuns populações derivadas por
autofecundação, a partir da geração F2 (tais como F3, F4,
etc...). Se um mesmo número de plantas F3 é obtido de cada planta F2,
ou um mesmo número de plantas F4 é obtida de cada planta F3,
e assim por diante, estas populações podem ser utilizadas para mapeamento
genético.
-Linhagens Endogâmicas Recombinantes (Recombinant Imbreed Lines - RILs): são também populações
derivadas por autofecundação a partir de uma população F2, porém as
populações são avançadas até atingirem um elevado grau de homozigose,
pelo método da descendência de uma única semente (SSD). Desta forma, cada
planta F2 gera uma planta F3, que por sua vez gera uma
planta F4 e assim por diante. Quando a população atinge a geração F6
ou F7, abrem-se linhas, que são as RILs.
Desta forma, cada planta F2 é representada por uma linha endogâmica homozigota. Assim, toda a variabilidade
existente na população F2 original estará representada pelas RILs, desde que um tamanho de população adequado seja
utilizado. Como todos os locos estão em homozigose, a variância de uma população composta por RILs é geralmente o dobro da variância na geração F2.
-Duplo Haplóides: obtidas pela
duplicação do número de cromossomos de grãos de pólen. Todos os indivíduos são
homozigotos e representam a variabilidade genética encontrada no indivíduo
parental que produziu os grãos de pólen.
-Retrocruzamento: são obtidas pelo cruzamento de plantas F1
com um dos progenitores. Apenas dois genótipos são obtidos (heterozigotos: Aa;
e homozigotos para o progenitor recorrente: aa).
Para
analisar corretamente os dados moleculares, é necessário ter conhecimento de
como esses dados são obtidos. Por este motivo, vamos listar as características
dos marcadores moleculares atualmente mais utilizados em mapeamento genético
(RFLP, RAPD, Microssatélites e AFLP).
Marcadores RFLP
(Restriction Fragment Lenght Polimorphism)
Consiste na digestão
(corte) do DNA com enzimas de restrição e hibridização com sondas de DNA. O DNA
digerido é submetido a eletroforese em gel de agarose. O produto deste gel é um "arraste" de
DNA, pois são gerados muitos fragmentos de diferentes tamanhos. O DNA é
transferido do gel para uma membrana de nitrocelulose, onde também é colocada
uma sonda (fragmento de DNA) marcada, geralmente com radioatividade (também
pode ser por fluorescência). A revelação é feita em filme de raio
X, e apenas os fragmentos que hibridizarem com a sonda produzirão uma
impressão (banda) no filme. É uma técnica relativamente complexa, que requer
grande quantidade de DNA em sua execução. Possui herança co-dominante (os três genótipos de um loco podem ser
identificados), mas requer conhecimento prévio do genoma para o desenvolvimento
das sondas. Por ser uma técnica altamente reprodutível, e por usar sondas de
DNA, permite o mapeamento comparativo. As sondas geralmente são partes de
genes, e portanto esta técnica analisa regiões
codificadoras do genoma.
A técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction)
Esta técnica consiste na síntese in
vitro de fragmentos de DNA. São colocados em uma reação, juntamente com o
DNA genômico, um par de "primers",
os oligonucleotídios (ATP, TTP, CTP e GTP), a enzima DNA
polimerase, e os co-fatores
necessários para a síntese de DNA. "Primers"
são pequenos fragmentos de DNA, com tamanhos que podem variar de menos de 10
até mais de 20pb, dependendo do objetivo da análise. A utilização da enzima DNA
polimerase obtida da bactéria Thermophilus
aquaticus (Taq
DNA polimerase), que é resistente a altas temperaturas, a técnica de PCR
pode ser automatizada. Para a amplificação de um fragmento de DNA são
necessárias três etapas: desnaturação, anelamento e
síntese. Vários ciclos contendo estas três etapas são realizados na técnica de
PCR.
Marcadores
moleculares derivados de PCR.
RAPD
(Random Amplified Polimorphic DNA)
Utiliza apenas um
"primer" de seqüência aleatória, com 10
bases. Teoricamente é possível sintetizar 5.040 "primers",
combinando os quatro em seqüências aleatórias de 10.
Algumas combinações no entanto não podem ser
utilizadas. Um "primer" deve conter algumas características
especiais, tais como:
- Não possuir extremidades coesivas, para não anelar-se consigo mesmo;
- Possuir mais de 50% de GC em sua composição, para que
a ligação com o DNA molde seja mais estável (G e C são ligados por três
pontes de hidrogênio, enquanto A e T são ligados por duas);
- Possuir G ou C na extremidade 5',
para que a ligação seja mais estável no local de início da síntese da
nova fita;
Nem
todos os "primers" disponíveis obedecem a
estas regras.
Considerando
que a seqüência do genoma de uma espécie seja
aleatória, um "primer" com 10 bases deve encontrar um sítios de anelamento a cada 410 pb. Para que uma região seja amplificável é
necessário que o "primer" encontre dois sítios em sentido oposto em
um intervalo máximo de 5000 pb.
A probabilidade de que isto ocorra é:
(5.000
/ 410) x (1/410) = 4,5 x 10-9
O
número de bandas esperado para cada "primer" RAPD é 4,5 x 10-9
x G, onde G é o tamanho do genoma haplóide, em pb. Por exemplo, o genoma da soja
possui 1,8x109 pb,
e cada "primer" deve produzir em média 8,1 bandas.
Por
utilizar "primers" aleatórios, o RAPD
mapeia todo o genoma, e não requer conhecimento prévio do genoma (o mesmo
conjunto de "primers" pode ser utilizado
para diferentes espécies). Como o DNA é amplificado muitas vezes, requer
quantidades mínimas de DNA. Além de ser derivada de PCR, a separação dos
fragmentos é feita em gel de agarose, o que torna a
técnica relativamente simples e de custo reduzido, além de poder ser
automatizada. Não utiliza radiatividade, e os fragmentos são corados com Brometo
de Etídio e visualizados sob luz ultra-violeta.
As
desvantagens do RAPD é que a técnica nem sempre é reprodutível, a presença de
uma banda na mesma posição em dois indivíduos diferentes não é garantia de que
são os mesmos alelos (podem ser fragmentos do mesmo tamanho
amplificados em locos diferentes), a ausência de uma determinada banda
em dois indivíduos não significa que seja o mesmo alelo (apenas que ambos
possuem alelo diferente daquele que é amplificado). Além disso, a técnica é
dominante, ou seja, o heterozigoto possui o mesmo padrão de um dos homozigotos.
MICROSSATÉLITES (ou SSR - Single Sequence
Repeat)
Microssatélites são regiões do
genoma que contém seqüências curtas (de 2 a 5 pb) repetidas várias vezes. As seqüências que flanqueiam estas regiões são conservadas
dentro da mesma espécie, o que permite que se construam "primers" que amplifiquem, via PCR, o mesmo loco, em
todos os indivíduos da espécie. Diferentemente do RAPD, para amplificar locos
de microssatélites utiliza-se um par de "primers",
cada um com sítio de anelamento localizado em um dos
lados da região repetitiva. O polimorfismo encontrado é de tamanho de
fragmentos, e é devido ao número diferente de cópias das seqüências
repetitivas.
AFLP
(Amplified Fragment Lenght Polimorphism)
Esta técnica reúne a
especificidade das enzimas de restrição com a praticidade do PCR. Após a
digestão do DNA genômico com enzimas de restrição,
são ligados adaptadores nas extremidades dos fragmentos gerados. Os adaptadores
podem ser ligados, pois o corte com as enzimas de restrição produz extremidades
desencontradas que são utilizadas para ligar os adaptadores. São utilizadas
duas enzimas de restrição, uma de corte freqüente (o
sítio de restrição possui 4 pb)
e uma de corte raro (sítio de restrição com 6 pb).
São gerados 3 tipos de fragmentos: a)com ambas as
extremidades cortadas pela enzima de corte freqüente,
b)com ambas as extremidades cortadas pela enzima de corte raro, e c)com uma
extremidade cortada com cada enzima. Estes últimos são amplificados para
aumentar sua freqüência na amostra de DNA a ser
avaliada. "Primers" complementares aos
adaptadores, e com diferenças nas 3 últimas bases da
extremidade 3' são utilizados para amplificar os fragmentos de AFLP. Os "primers" possuem cerca de 20 bases, o que garante
especificidade e reprodutibilidade aos resultados. Como o polimorfismo é dado
pela presença ou ausência do sítio de anelamento do
"primer", o resultado é observado como presença ou ausência de banda,
sendo o AFLP também um marcador dominante, como o RAPD. É uma técnica
sofisticada, e que envolve muitas etapas. O sítio de anelamento
do "primer" é constituído das três bases da extremidade 3' do "primer" (o restante do "primer"
anela no adaptador), e portanto muitas bandas são amplificadas por cada combinação
de "primers". Géis de seqüenciamento
devem ser utilizados na separação dos fragmentos amplificados. Utiliza
radioatividade ou fluorescência para a visualização dos fragmentos.